发布日期：2026-02-21 07:33    点击次数：142

AAT Bioquest的iFluor 染料历程优化，可用于标记卵白质，非常是抗体。这些染料亮堂、耐光开yun体育网，对卵白质的淬灭作用最小。它们不错被荧光仪器的主要激明后（举例350、405、488、555和633nm）很好地引发。iFluor®647系列的光谱特色与Cy5 基本相易。与Cy5®探针比拟，iFluor 647试剂具有更强的荧光和更高的光雄伟性。它们的荧光在pH 3至11界限内与pH无关。这些光谱特色使这种新的染料眷属成为Cy5和Alexa Fluor 647的绝佳替代品（Cy5与Alexa Fluor是GE Health Care和Invitrogen的商标）。iFluor®647 SE畸形雄伟，与卵白质氨基具有细密的响应性和选拔性。

艾好意思捷iFluor 647琥珀酰亚胺酯：

货号：AAT-71560

单元大小：1 毫克

分子量：1274.66

溶剂：DMSO（二甲基亚砜）

转变因子（260 纳米）：0.03

转变因子（280 纳米）：0.03

转变因子（656 纳米）：0.0793

消光统统（cm -1 M -1）：250000

引发（纳米）：656

辐射（纳米）：670

量子产率：0.25

H-短语：H303, H313, H333

危急标识：XN

预期用途：仅限商议使用（RUO）

R-短语：R20, R21, R22

储存：冷冻（< -15 °C）；尽量减少光照自大

库存溶液的准备：除非另有阐扬，统统未使用的库存溶液应在制备后分红单次使用的小份，并储存在 -20 °C。幸免反复冻融轮回。

卵白质库存溶液（溶液 A）：

将 100 微升的响应缓冲液（举例，1 M 碳酸钠溶液或 pH 约 9.0 的 1 M 磷酸缓冲液）与 900 微升的目标卵白质溶液（举例，抗体，卵白质浓度尽可能大于 2 mg/mL）羼杂，得到 1 毫升卵白质标记库存溶液。

能干：卵白质溶液（溶液 A）的 pH 值应为 8.5 ± 0.5。若是卵白质溶液的 pH 值低于 8.0，请使用 1 M 碳酸氢钠溶液或 1 M pH 9.0 磷酸缓冲液调换 pH 值至 8.0-9.0 界限内。

能干：卵白质应熔解在 1X 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）中，pH 7.2-7.4。若是卵白质熔解在 Tris 或甘氨酸缓冲液中，必须对其进行透析，以造反 1X PBS，pH 7.2-7.4，以去除庸俗用于卵白质千里淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和醋酸铵）。

能干：不纯的抗体或用牛血白嫩卵白（BSA）或明胶雄伟的抗体将不会被很好地标记。亚硝酸钠或硫柳汞的存在也可颖异扰偶联响应。亚硝酸钠或硫柳汞不错通过透析或旋转柱走动除，以取得最好的标记终局。

能干：若是卵白质浓度低于 2 mg/mL，偶联后果将显耀裁减。为了取得最好的标记后果，提议最终卵白质浓度界限在 2-10 mg/mL 之间。

iFluor™ 647 SE 库存溶液（溶液 B）：

向 iFluor™ 647 SE 的瓶中加入无水 DMSO，制成 10 mM 库存溶液。通过移液或涡旋羼杂均匀。

能干：在驱动偶联之前准备染料库存溶液（溶液 B）。请立即使用。染料库存溶液的永远储存可能会裁减染料活性。溶液 B 不错在避光和防潮的情况下在冷冻库中储存两周。幸免冻融轮回。

样品实践契约：

这个标记契约是为山羊抗小鼠 IgG 与 iFluor™ 647 SE 的偶联而开荒的。您可能需要把柄您的特定卵白质进行进一步优化。

能干：每种卵白质齐需要不同的染料/卵白质比例，这也取决于染料的性质。过度标记卵白质可能会对其蚁集亲和力产生不利影响，而染料/卵白质比例过低的卵白质偶联物则机灵度裁减。

进行偶联响应：

使用 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（卵白质）的摩尔比例算作起始：将 5 微升的染料库存溶液（溶液 B，假定染料库存溶液为 10 mM）加入卵白质溶液（95 微升的溶液 A）的瓶中，并有用摇动。假定卵白质浓度为 10 mg/mL，卵白质分子量约为 200KD，卵白质的浓度约为 0.05 mM。

能干：咱们提议使用 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（卵白质）的摩尔比例。若是太低或太高，请折柳细则 5:1、15:1 和 20:1 的最好染料/卵白质比例。

接续在室温下旋转或摇动响应羼杂物 30-60 分钟。

纯化偶联物：

以下是一个使用 Sephadex G-25 柱纯化染料-卵白质偶联物的示例契约。

把柄制造商的阐扬准备 Sephadex G-25 柱。

将响应羼杂物（来自“运行偶联响应”）加载到 Sephadex G-25 柱的顶部。

当样品刚刚低于顶部树脂名义时，立即添加 PBS（pH 7.2-7.4）。

添加更多的 PBS（pH 7.2-7.4）以完成所需的样品柱纯化。归拢包含所需染料-卵白质偶联物的分数。

能干：若是立即使用，染料-卵白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并分装屡次使用。

能干：关于永远储存，染料-卵白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

表征所需的染料-卵白质偶联物

取代度（DOS）是表征染料标记卵白质的最病笃身分。较低 DOS 的卵白质频频具有较弱的荧光强度，但较高 DOS 的卵白质也倾向于裁减荧光。关于掀开阔抗体，推选的最优 DOS 在 2 到 10 之间，具体取决于染料和卵白质的性质。为了有用标记，应物化取代度，使每摩尔抗体有 4-6 摩尔的 iFluor™ 647 SE。以下本事用于细则 iFluor™ 647 SE 标记卵白质的 DOS。

测量收受：

为了测量染料-卵白质偶联物的收受光谱，提议保抓样品浓度在 1-10 µM 界限内，具体取决于染料的消光统统。

读取 OD（吸光度）在 280 纳米和染料最大收受（λmax = 656 纳米，关于 iFluor™ 647 染料）

关于掀开阔分光光度计，需要将样品（来自柱分数）用去离子水稀释，以便 OD 值在 0.1 到 0.9 的界限内。280 纳米的 O.D.（吸光度）是卵白质的最大收受，而 656 纳米是 iFluor™ 647 SE 的最大收受。为了取得准确的 DOS，请确保偶联物中不含未偶联的染料。

图：HeLa细胞用小鼠抗微管卵白染色开yun体育网，然后用iFluorTM 647山羊抗小鼠IgG（H+L）（红色）染色；细胞核用DAPI（蓝色）染色。

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